култивиране на стволови клетки

култивиране на стволови клетки

  Много млади родители изглеждат объркани пред цялостната идея за това какво представляват стволовите клетки и как действат те. Затова решихме да разкрием още един аспект от работата в сферата на регенеративната медицина, а именно как изглежда една лаборатория за добив и култивиране на плурипотентни стволови клтеки.

      Процесът на изграждане на подобна лаборатотия често се разделя на два основни аспекта – единият е чисто юридическият и административен въпрос по установяването на подобна лаборатория, а вторият е често физическият и технически компонент на лабораторията. От една страна, имаме всички доклади, отчети и разрешителни, които дадено юридическо лице трябва да предостави, за да работи в тази сфера. От друга страна, имаме дизайнът, апаратурата и намирането на качествен персонал за лабораторията. Днес и двете сфери у нас не добре познати. И докато държавата се опитва да облекчи бюрократичните процедури, с цел да улесни науката и медицината, и възможността на пациентите да получат качествено лечение, въпросът с намирането на апаратура и специалисти, които знаят как да проектират такава клиника или имат уменията да работят в нея си остава предизвикателство. Именно по тази причина на много места по света компаниите, които се занимават с добив и култивиране на стволови клетки са големи световни конгломерати, които имат възможност лесно да приложат стандартите си, в която и да било държава.

     Качественото планиране и дизайн на подобна лаборатория е главна задача при започването на проекта. Това очевидно е дългосрочна инвестиция, която крие потенциални ползи не само за създателите си, но и за човечеството. Една добре изградена лаборатория служи като изследователски център и постоянно работи за оптимизирането на отношението вложени-получени ресурси.

     Създаването на добре работеща лаборатория за култивиране на човешки плурипотентни стволови клетки дава основата за успешното култивиране и експериментиране с клетките. Всъщност този тип лаборатории се различават драстично от тези за обработка и култивиране, на които и да било други човешки клетки. За да разберем добре какви са разликите между обикновените лаборатории и тези за стволови клетки, важно е да имаме ясна предсава какво стои зад самия процес на култивиране. За целта вижте илюстрацията по-долу:

процес на култивиране

процес на култивиране

      Най-общо дефинирахме четири основни компонента, необходими за да функционира лабораторията успешно:

  • Добър дизайн
  • Отговорен персонал
  • Добро оборудване
  • Стандартизирани процедури

      Тези фактори остават напълно валидни дори и когато просто обновявате или преквалифицирате вече съществуваща лаборатория. Трябва внимателно да бъдат обмислени техниката и количеството специалисти, както и вида дейности, които ще се извършват в рамките на бюджета, който сте си определили. Прилагането на модулен дизайн както при принципите, по които ще действа лабораторията, така и при подбора на техниката, позволява на лабораторията да расте и да се развива според нуждите й.  От ключово значение е определянето на точня обхват на лабораторията – какви видове и какви количества стволови клетки ще третира тя, определяне на броя на хората, които ще работят в нея. Важно е да се определи колко стволови клетъчни линии ще бъдат поддържани и характеризирани. Ако повече от една линия ще бъде култивирана по едно и също време, какви предпазни мерки трябва да бъдат предприети, за да се предотврати евентуално кръстосано заразяване. Как ще бъдат въвеждани новите линии в лабораторията? Важно е да се осигури пространство за постъпващия биологичен материал, за тестване, съхранение и адекватното изхвърляне на остатичния материал. Различното от това в нормалната клетъчна лаборатория е, че трябва да бъдат обособени пространства за култивиране, микроскопия, биохимия и молекулярна биология.

Екипировка

стволови клетки микроскоп

стволови клетки микроскоп

      В тази секция ще разгледаме минимума от апаратура, която е необходима за култивирането и характеризирането на стволови клетки. Дадена програма може да изисква специализирани устройства за култивиране, като инкубатори и други средства, които осигуряват среда под налягане с ниско съдържание на кислород. Ние ви представяме само стандартната апаратура за култивиране на стволови клетки.

 Лаборатория за култивиране на тъкани

  • Клас II биобезопасен кабинет
  • СО2 инкубатор
  • Аспирация
  • Пипети
  • Нискоскоростна центрофуга за завъртане на клетките
  • Водна баня 37°C

1. Микроскопско помещение

  • Фазово-контрастен микроскоп
  • Дисекционен хороскоп

2. Хранилище

  • Шкафове и рафтове за съхранение на материалите
  • Хладилник
  • Фризер
  • Фризер на ниски температури – −70 to −85°C
  • Криогенен фризер – под −140°C

3. Лаборатория по молекулярна биология

  • RT-PCR
  • Поточен цитометър
  • Флуоресцентен микроскоп
  • Конфокален микроскоп

4. Лаборатория за карантина

  • Клас II биобезопасен кабинет
  • СО2 инкубатор
  • Фазово-контрастен микроскоп
  • Водна баня 37°C
  • Нискоскоростна центрофуга за завъртане на клетките
  • Пипети
  • Аспирация
  • Мивка

5. Трябва да има осигурен достъп и до:

  • Микроскопи
  • Поточни цитометри
  • Геномика
  • Протеомиката
  • Продукция на вируси
  • Развъдник

 Методи

1.   Дизайн

     При изграждането на ново лабораторно пространство, дизайнерският екип обикновено включва архитект, доставчик, строител, електричар, механик, водопроводчик, както и директора или мениджъра на лабораторията. Обикновено ако екипът има за цел само да преустрои вече съществуваща лаборатория, той е по-малък, но все още е съставен от определено количество хора, които имат специализирани познания. Ремонтът на една таква лаборатория не е възможен без помощта на строители, електричари, водопроводчици и механици. Смята се, че обновяването на вече съществуваща лаборатория е от 3 до 5 пъти по-евтино. Модулният дизайн пък позволява лесното й преконфигуриране при евентуална нужда.

      Основни параметри на планирането и дизайна

  • Бюджет – Първо трябва да сме наясно с колко пари разполагаме и за какъв период от време трябва да ги използваме. Възвращаемостта на инвестицията също трябва да бъде изчислена внимателно.
  • Пространство – Има значение какъв тип е пространството, с което разполагаме, дали то е било склад, рехабилитационна, офис или лаборатория. От квадратурата ще зависи как ще обособим помещенията.
  • Определете какъв тип работа ще се извършва в лабораторията – Това ще е от ключово значение за нейната био-безопасност, за екипировката и специалистите, които ще наемете.
  • Главни помещения за работа – Предвидете пространства за  лаборатория за култивиране на тъкани, лаборатория за карантина, молекулярна биология, лаборатория за контрол на качеството и микроскопска лаборатория.
  • Персонал – Колко души? В кои области ще работят? Съобразно това ще можете да решите колко офиса, колко бюра, индивидуални ли ще бъдат те или за общо ползване, колко да е голяма стаята за почивка. Не подценявайте подготовката на персонала. Единствено тя може да ви гарантира постоянното развитие на лабораторията в позитивна посока. Видеото по-долу илюстрира само някои от аспектите на обучението за работа със стволови клетки.

Компоненти на работа в лабораторията за стволови клетки

  • Хладилни помещения – Колко фризера ще ви трябват и от какъв тип, резервен генератор, алармена система, отделен криогенен фризер с ограничен достъп до него.
  • Хранилища и допълнителни помещения към лабораториите – шкафове, рафтове, тоалетни шкафчета, масички на колелца, поставки за епруветки и други.
  • Информационни технологии – Добре е да обособите ИТ-зона. Там, където ще бъдат рутерите и цялата инфраструктура, необходима за мрежата на лабораторията.

2.   Основни съображения по строежа – Съществуват някои концептуални основополагащи принципи при конструкцията на подобна клиника. Те трябва да бъдат решени от мениджмънта и съгласувани с целия екип.

  • Водна инсталация, механика, проектиране – резервни генератори, аларми и системи за контрол с достъп до отделните помещения; доставка на CO2 и LN2; вакумни системи.
  • Отоплените, климатизация и вентилация – Броят на био-безопасните кабинети има определяща роля в цялостната схема на лабораторията и може значително да оскъпи крайната инвестиция. Въздушната инсталация трябва да бъде проектирана така че да може да поддържа различните видове био-безопасни зали, същото важи и за други термални съоръжения като инкубатори и фризери. Ефективната и качествена климатизация на помещенията в лабораторията е едно от най-сериозните предизвикателства при проектирането. Може да се окаже изключително трудно да работите в среда, където топлината не може да бъде регулирана, защото климатичната инсталация няма достатъчно капацитет, за да регулира топлината, произведена от био-безопасните помещения и инкубаторите. Посоката на въздушните течения е ключов фактор при дизайна на лабораторията и е от критично значение за нормалното опериране на заведението.
  • Електричество и маршрутизация – Направете си ясна прогноза за това какъв тип електрическа инсталация е необходима, както и за това как ще бъде поддържана тя. Изискванията към всички устройства, включително и спрямо контактите, ключовете за осветлението, определянето на мерки за сигурност и при спешност, близостта на контактите до източници на вода, както и координирането на разположението на контактите спрямо модулите за обзавеждане, са основна част от проектирането на ел-инсталацията на лабораторията. Всички фризети и инкубатори трябва да бъдат свързани и с резервния електрически генератор, както и с алармената система.
  • Финални щрихи по интериора – винилови настилки, непорести тавани, непромокаеми бои и покрития, лесни за почистване, импрегнирани тапицерии.

Следват и различните помещения

 1. Зона за култивиране на тъкани

зона за култивиране

зона за култивиране

     Зоната за култивиране на тъкани се състои от минимум апаратура. Сетът включва биологично безопасен кабинет, CO2 инкубатор, един фазово-контрастен микроскоп, центрофуга с ниска скорост, вакуум, водна баня, две-2L колби, поставка за пипети, микропипети, и един шкаф или количка за по-лесен достъп при доставки за тъканни култури. Ако се придържате към концепцията на модулния дизайн, можете да оптимизирате резултата, като увеличите броя на модулите за тъканно култивиране. В средно-статистическата лаборатория за стволови клетки един модул може да побере един или двама техници. Улесненият достъп до криогенните хранилища, центрофуги, микроскопи, хладилници и фризери е задължителен за функционалността на лабораторията. Помислете как да ги разпределите, така че те да бъдат споделени от техниците в отделните модули.

2. Лаборатория по молекулярна биология

     Лабораторията по молекулярна биология и контрол на качеството се състои от апаратура, която служи за редица предопределени процедури за характеризиране на материала. Културите биват тествани за определени маркери, цитогенетични структури, способност за диференциране и други.

3. Лаборатория за карантина

     Подаването на нови клетъчни линии в лабораторията е основният източник на заразни култури. Затова е и важно системата да бъде контролирана, за да се намали рискът от зараза. Карантината обикновено се провежда в отделна лаборатория, като клетките могат да бъдат под карантина по време на конкретна процедура, докато задаващата се линия не бъде култивирана от специалистите и отпратена към съответния инкубатор.

4. Хранилище

     Правилното внасяне и съхранение на стволовите клетки и реагентите, включително и запасите от клетки, е ключът към дългосрочния успех на лабораторията. Когато устройвате нова лаборатория, съществува възможност да подготвите система за администриране на подаваните припаси и техния произход. Много от реагентите в лабораториите за стволови клетки са извлечени от животни, което създава възможност за вариации между отделните проби и налага тестването им в самата лаборатория, за да се определи доколко са подходящи за употреба. Освен това проследяването на сроковете на годност на наличните проби и подредбата им става чрез система от баркодове, които се генерират на местно ниво.

5. Контрол по качеството 

контрол по качеството

    Лабораторията следва да бъде проектирана, екипирана и управлявана по начин, който позволява надеждно производство на стволовите клетки и резултати от проведените експерименти, които да могат да бъдат проследени. Докато изследоватлската лаборатория трябва да проявява достатъчно гъвкавост, за да улесни откритията и да спомогне за установяването на стандартизирани процедури, контролът по качеството е този, който следва да ограничи тази гъвкавост, така че да се стигне до надеждни резултати. Контролът по качеството има няколко измерения:

5.1 Техники, на които можем да разчитаме – При създаването на лаборатория за стволови клетки установяването на надеждни техники е основна стъпка от култивирането и характеризирането на клетъчните линии. Именно определянето на тези техники е най-сериозната задача на мениджъра на лабораторията. Лабораторният мениджър не само трябва да има много тесни познания в научната област и всички най-актуални открития, но и да има оперативните познания за това кои са пропорционалните на пазара решения. Задача на мениджъра е и да се погрижи персоналът му да има необходимите познания, за да започне работа с вече добит опит и ясна представа за прилаганите техники. Стратегията, при която „самолетът се строи, докато лети“ не дава добри резултати в подобни сфери, които има решаващо влияние върху човешкото здраве.

5.2 Проверени реагенти – От огромно значение е реагентите, които се използват при култивирането, да бъдат проверени и доказано надеждни. Много вещества, особено тези, извлечени от животни, като говеждия серум и мишите ембрионални фибробласти имат определящо влияние върху качеството на крайния резултат.

качествени стволови клетки

качествени стволови клетки

5.3 Качествени стволови клетки – Важно е наличните стволови клетки да са от добре характеризирани източници, които имат морфологичните и генетичните характеристики на високо качествени стволови клетки. Добре характеризираните линии от стволови клетки са гръбнака на успешното тестване, изследване и култивиране на клетки в лабораторията.

5.4 Основни критерии – Установяването на стандарти за периодичното тестване на културите. Важно е стволовите клетки да не са заразени под никаква форма, да имат нормален кариотип, да изразяват определени маркери, да могат да се диференцират в клетки, получени от трите зародишни слоя.

Разрешителни и пълномощни

      При въвеждането на нова лаборатория за култивиране на стволови клетки, получаването на съответните разрешителни е основна грижа. Тези разрешителни могат да варират за отделните държави, макар и в рамките на ЕС изискванията да са повече или по-малко стандартизирани. В повечето случаи ще бъде формиран комитет, към който биват подадени данни за източниците на биологичния материал, съхранението и третирането му. Преди издаването на разрешително трябва да можете и да удостоверите, че клиниката разполага със специалисти, които да следват необходимите процедури.

       Разбира се, не забравяйте и маркетинга на лабораторията. Макар и от второстепенно значение, той е особено нужен при малки пазари, които са и по-консервативни. На линка по-долу ще откриете една от добрите практики за достъпно позициониране на проект, свързан със стволовите терапии ‘Hope Beyond Hope’.